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PCR實驗室設計與建設中應注意的問題
發布時間:2019-05-29 09:21瀏覽次數:

一、什么是PCR實驗室

 PCR是聚合酶鏈式反應(PolymeraseChainReaction)的簡稱。聚合酶鏈式反應也可以當作一項極其重要的酶促合成DNA技術。PCR又稱為無細胞克隆系統或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增法,是基因擴增技術的一次重大革新,它可將極微量的靶DNA特異地擴增上百萬倍。
 聚合酶鏈反應(PCR)是在DNA聚合酶催化下,以母鏈DNA為模板以特定引物為延伸起點,通過變性、退火、延伸等步驟,體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。是一項DNA體外合成放大技術,能快速特異地在體外擴增任何目的DNA。可用于基因分離克隆,序列分析,基因表達調控,基因多態性研究等許多方面。
 一對合成DNA的引物經過高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段為一個循環,每一次循環使特異區段的基因拷貝數放大一倍,一般樣品是經過30次循環,最終使基因放大了數百萬倍;將擴增產物進行電泳,經溴化乙錠染色,在紫外燈照射下肉眼能見到擴增特異區段的DNA帶。
二、設計要點
1、主體結構:
 目前實驗室的主體多為彩鋼板、鋁合金型材。室內所有陰角、陽角均采用鋁合金R50內圓角鋁,從而解決容易污染、積塵、不易清掃等問題。并且彩鋼板結構牢固,線條簡明,美觀大方,密封性好。
2、標準的四區分隔和氣壓調節:
 將PCR過程分成試劑準備、標本制備和PCR擴增區及產物分析檢測區四個獨立的實驗區。整個區域有一個整體緩沖走廊。每個獨立實驗區設置有緩沖區,同時各區通過氣壓調節,使整個PCR實驗過程中試劑和標本免受氣溶膠的污染并降低擴增產物對人員和環境的污染。
3、消毒:
 在四個實驗區和四個緩沖區頂部以及傳送窗內部安裝有紫外燈,供消毒用。在試劑準備區和標本制備區還設置移動紫外線燈,對實驗桌進行局部消毒。
4、機械連鎖不銹鋼傳遞窗:
 試劑和標本通過機械連鎖不銹鋼(不建議使用電子連鎖方式)傳遞窗傳遞,保證試劑和標本在傳遞過程中不受污染(人物分流)。
5、地面
 地面建議使用PVC卷材地面或自流坪地面,整體性好。便于進行清掃,耐腐蝕。沒有條件的也可采用水磨石地面,或大塊的瓷磚(至少800mm×800mm)接縫需要小于2mm。
6、照明
 燈具要選用凈化燈具,能達到便于清洗、不積塵的特點。另外:
?PCR實驗室可分為兩個大的功能工作區域:核酸擴增前區和核酸擴增后區。核算擴增前區包括試劑準備間和樣本制備間,這個兩房間各自獨立,不能出現空氣互通,這兩個房間相對外界氣壓呈正壓狀態。核酸擴增后區包括擴增區和產物分析區,使用實時熒光PCR儀、HIV病毒載量測定儀的PCR實驗室,這個兩區域可以合并為一個房間。這個區域如果是分開兩個房間,這兩個房間也必須是各自獨立,不能出現空氣互通。核算擴增后區對外界氣壓呈負壓狀態。
 PCR實驗室根據使用儀器的功能合理設置各個工作區域,如采用聚合酶聯反應:則設置試劑儲存和準備區、標本制備區、擴增區、擴增產物分析區四個單獨的工作區域,這是最常用的分區方式。樣品需要粉碎處理的,還需增設樣品粉碎區;若使用實時熒光PCR法:基因擴增區、基因產物分析區可以合并在一個房間內;采用標本處理、核酸提取及擴增檢測為一體的全自動化PCR分析儀,則標本制備區、擴增區、擴增產物分析區可合并為一個區域,因此PCR實驗室原則上設置五個區或四個區或三個區或二個單獨的工作區。
 核酸擴增前區和核酸擴增后區可設在一個房間內,但必須在滿足下列要求的前提下:
a.核酸擴增前區實驗室內設置兩個不同位置的實驗區,試劑配置在超凈工作臺中操作,樣品處理在生物安全柜內操作。
b.在核酸擴增后區使用全封閉的擴增和檢測系統,如實時熒光PCR儀等。
c.每個實驗人員使用各自的試劑、耗材、移液器和盛放污染物的盛器。
d.在實驗前后對操作區域和共享器具進行清潔及消毒。
e.各區域的試劑、器具、儀器和設備為該區專用,不得交叉使用。
三、空氣流與壓差要求
 PCR實驗室的空氣流向必須嚴格按照試劑儲存和準備區→標本制備區→擴增區→擴增產物分析區空氣壓力逐漸遞減方式進行,防止擴增產物順空氣氣流進入擴增前的區域。風速流向不得混亂。
 為了保證房間內的壓差和避免污染,應在空調面板處寫清楚送風機和排風機的開啟順序和關閉順序,先后順序不得混亂。
 空氣潔凈級別不同的相鄰房間之間的靜壓差應大于5帕,潔凈室(區)與室外大氣的靜壓差應大于10帕,應配備監測靜壓差的設備,并定期監控。
 一般情況下,試劑配制室及樣品處理室宜呈微正壓,以防外界含核酸氣溶膠的空氣進入,造成污染;可以通過控制進風風量大于排風風量達到正壓效果。
 核酸擴增室及產物分析室應呈微負壓,以防含核酸的氣溶膠擴散出去污染試劑與樣品,可以通過控制排風風量大于進風風量達到負壓效果。
 在理想情況下,PCR實驗室緩沖間內,可設置正壓,使室內空氣不流向室外,室外空氣不流向室內。PCR實驗室進風由原有中央空調控制的要求將中央空調風口安裝到指定定點。
四、實驗室面積及設備間距
 一般來說各房間的面積沒有嚴格要求,只需能放置所需儀器設備,并且便于人員操作即可,但是有生物安全柜的房間面積不能小于10平米,并且每增加一臺生物安全柜,房間就要增加10平米。
 各實驗室緩沖間的面積一般為1300*(1300或1500)mm為宜,并且緩沖間的面積不能大于實驗室房間面積的1/8。
 在做平面設計的時候,首先要考慮的因素是就是“安全”,實驗室是最易發生爆炸、火災、毒氣泄露等的場所。我們在做平面設計的時候,應盡量地要保持實驗室的通風流暢、逃生通道暢通。根據國際人體工程學的標準。我們做如下的劃分以供參照:實驗臺與實驗臺通道劃分標準(通道間隔用L表示)L>500mm時,一邊可站人操作;L>800mm時,一邊可坐人操作;
L>1200mm時,一邊可坐人,一邊可站人,中間不可過人;
L>1500mm時,兩邊可坐人,中間可過人;
L>1800mm時,兩邊可坐人,中間可過人可過儀器
 天平臺、儀器臺不宜離墻太近,離墻400mm為宜。為了在工作發生危險時易于疏散,實驗臺間的過道應全部通向走廊。另:實驗室建筑層高宜為3.7米-4.0米為宜,凈高宜為2.7米-2.8米,有潔凈度、壓力梯度、恒溫恒濕等特殊要求的實驗室凈高宜為2.5米-2.7米(不包括吊頂);實驗室走廊凈寬宜為2.5米-3.0米.普通實驗室雙門寬以1.1米-1.5米(不對稱對開門)為宜,單門寬以0.8米-0.9米為宜。
五、潔凈裝修要求
 潔凈室(區)的內表面應平整光滑、無裂縫、接口嚴密、無顆粒物脫落,并能耐受清洗和消毒,墻壁與地面的交界處宜成弧形或采取其他措施,以減少灰塵積聚和便于清潔。
 潔凈室(區)內各種管道、燈具、風口以及其他公用設施,在設計和安裝時應考慮使用中避免出現不易清潔的部位。
 潔凈室(區)的窗戶、天棚及進入室內的管道、風口、燈具與墻壁或天棚的連接部位均應密封。
六、工作服要求
 在凈化車間內工作的人員應穿著符合要求的工作服。工作服的選材、式樣及穿戴方式應與生產操作和空氣潔凈度級別要求相適應,并不得混用。潔凈工作服的質地應光滑、不產生靜電、不脫落纖維和顆粒性物質。無菌工作服必須包蓋全部毛發、胡須及腳部,并能阻留人體脫落物。不同空氣潔凈度級別使用的工作服應當分別清洗、整理,必要時消毒或滅菌。工作服洗滌、滅菌時不應帶入附加的顆粒物質。工作服應制定清洗周期。
 進入各個區域必須嚴格按照單一方向進行,不同的工作區域使用不同的工作服(例如不同的顏色)。工作人員離開時,不得將工作服帶出。
 實驗室應建立、執行人員進出潔凈區的清潔程序和管理制度,人員清潔程序合理。
七、人流路徑與物流路徑
 進入實驗室區域工作人員應該按照以下路徑:
 公共清潔區——更衣間(更換潔凈服)——緩沖間——污染實驗區
 工作人員退出實驗室的路徑為:
 污染試驗區——緩沖間——淋浴間(有條件的可設置)——更衣間——公共清潔區所有的物品進入實驗區必須經過雙扉互鎖傳遞窗,利用傳遞窗消毒后才可進入,實驗室內所有物品的也必須經過傳遞窗才可以傳遞到實驗室以外的清潔公共區。
八、門的開啟方向
 實驗室建筑層高宜為3.7米-4.0米為宜,PCR實驗室凈高宜為2.5米-2.7米(不包括吊頂);實驗室走廊凈寬宜為2.5米-3.0米.普通實驗室雙門寬以1.1米-1.5米(不對稱對開門)為宜,單門寬以0.8米-0.9米為宜。
 一般實驗室門主要向里開,但如有危險的房間,房門應朝外開,房門材質最好選擇壓力玻璃。
 有壓差梯度的房間,門的開啟方向應朝向正壓方向一側開啟;
 考慮到消防安全,對于那些主要逃生門的開啟方向應朝向清潔區方向開啟。
九、基本儀器設備考慮
(1)試劑貯存和準備區
 該實驗區主要進行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應混合液的制備。試劑和用于樣品制作的材料應直接運送至該區,不得經過其他區域。試劑原材料必須貯存在本區內,并在本區內制備成所需的貯存試劑。對與氣流壓力的控制,本區應對外界保持微正壓。
 試劑準備區儀器設備主要應有加樣器、冰箱、天平、低速離心機、混勻器、可移動紫外燈等。可使用超凈工作臺作為試劑配制操作臺面。
(2)標本制備區
 該區域主要進行的操作為樣本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應管和測定DNA的合成。本區的壓力梯度要求為:相對于鄰近區域為正壓,以避免從鄰近區進入本區的氣溶膠污染。另外,由于在加樣操作中可能會發生氣溶膠所致的污染,所以應避免在本區內不必要的走動。
 標本制備區儀器設備主要應有生物安全柜(最好為B2,可避免提取核酸在柜內反復循環,造成標本間交叉“污染”,出現假陽性結果。此外還應配備加樣器、臺式高速離心機(冷凍及常溫)、臺式低速離心機、恒溫設備(水浴和/或干浴儀)、冰箱、混勻器和可移動紫外燈等。
(3)擴增和擴增產物分析區
 該區域主要進行的操作為DNA擴增和擴增片段的測定。此外,已制備的DNA模板(來自樣本制備區)的加入和主反應混合液(來自試劑貯存和制備區)制備成反應混合液等也可在本區內進行。本區的壓力梯度要求為:相對于鄰近區域為負壓,以避免氣溶膠從本區漏出。為避免氣溶膠所致的污染,應盡量減少在本區內的不必要的走動。個別操作如加樣等應在超凈臺內進行。
 擴增區主要儀器就是核酸擴增熱循環儀(PCR儀,實時熒光或普通的)。熱循環儀的電源應專用,并配備一個穩壓電源或UPS,以防止由于電壓的波動對擴增測定的影響。此外,根據工作需要,還可配備加樣器、超凈臺等。
 產物分析區:本區所使用的儀器設備可能有加樣器、電泳儀(槽)、電轉印儀、雜交爐或雜交箱、水浴箱、DNA測序儀、酶標儀和洗板機等。
十、實驗室風量測算
1、排風量的計算方法:
 根據面風速來確定排風量(面風速的一般取值為:0.3~0.5m3/h)計算公式:
G=S•V•h•μ=L•H•3600•μ
十一、安全注意問題
A、生物安全柜的擺放位置不易擺放在與出入口緊鄰的墻體上;
B、實驗室內的通訊設施應該放置于生物安全柜對面;
C、實驗室門口位置設置緊急洗眼器和緊急噴淋,以防止實驗人員受到傷害;
D、高壓滅菌器應與傳遞窗緊鄰;
E、實驗室內的壓力顯示器和報警裝置都應放置在醒目位置;
F、與室外聯系的電話應放置在醒目位置,并且放置在便于實驗室人員快速拿起的位置;
G、實驗室應該具有防止昆蟲和其他動物進入的措施。
十二、PCR實驗室管理
(1)嚴格控制進出實驗室的人員。與實驗無關的人員不得隨意進出實驗室,有條件的情況下要設置獨立的通道和進出整個實驗區的門;
(2)盡量減少在實驗區內不必要的走動以減少交叉污染的可能性;
(3)擴增產物分析區是最主要的擴增產物污染來源,廢液不能在實驗室中傾倒,必須經消毒液浸泡消毒后在遠離實驗室的地方棄掉,用過的吸頭等一次性材料也應經消毒液浸泡消毒后統一處理,如焚燒等;
(4)擴增產物分析區可能會用到某些可致基因突變和有毒物質,應特別注意實驗人員的安全防護。
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